Biologie moléculaire

Biologie moléculaire

La biologie moléculaire, une branche de la BIOCHIMIE, étudie la structure, la synthèse et la dégradation des macromolécules (les très grosses molécules) des cellules vivantes, ainsi que leur régulation métabolique (le contrôle de leur synthèse ou de leur dégradation dans la cellule) et leur expression (comment l'information GÉNÉTIQUE contrôle leur synthèse et leur structure). Les macromolécules comprennent les acides nucléiques, ADN (acide désoxyribonucléique) et ARN (acide ribonucléique), les protéines (y compris les enzymes), les glucides, les complexes formés de glucides et de protéines et les lipides (les cires et les gras produits par les cellules). Le terme a été utilisé pour la première fois par Oswald T. Avery vers la fin des années 40 et a été associé dès le début à l'étude des acides nucléiques.

ADN

À la suite de leur travail sur les BACTÉRIES, les chercheurs canadiens Oswald Avery et Colin M. MacLeod et l'Américain Maclyn McCarty ont été les premiers à prouver que l'ADN constituait le matériel génétique de la cellule (1944). L'ADN a une structure en « double hélice ». Cette structure a été décrite pour la première fois en 1953 par l'Américain J.D. Watson (prix Nobel, 1962), qui a été influencé par le travail d'Avery, et par le chercheur britannique Francis Crick. La double hélice est formée d'un « squelette » fait de deux chaînes antiparallèles de sucres et de phosphates réunies entre elles par des paires complémentaires de bases azotées.

La description de l'appariement des bases azotées par l'Américain Edwin Chargaff ainsi que les recherches de la biophysicienne Rosalind Franklin sur la diffraction des rayons X ont contribué de façon importante à la découverte de Watson et de Crick. Peu avant la découverte de la structure de l'ADN par Crick et Watson, G. Wyatt, aujourd'hui à l'emploi de l'U. Queen, avait décrit la 5-méthylcytosine, une importante base azotée constituant l'ADN, et avait confirmé que les bases azotées, dans l'ADN, sont appariées deux à deux. Il avait aussi déterminé la composition en bases azotées de nombreux échantillons d'ADN.

Ce sont les biochimistes français Jacques Monod et François Jacob (PRIX NOBEL, 1965) qui ont émis l'hypothèse que l'ADN servait de matrice à la formation de l'ARN. On appelle transcription le mécanisme par lequel l'ARN est produit à partir de l'ADN et traduction la production de protéines à partir de l'ARN. Après traduction, la protéine nouvellement produite peut, selon le type de cellule, subir de nombreuses transformations (p. ex. l'ajout de glucides ou de lipides), formant ainsi les protéines complexes caractéristiques de la structure de nombreuses cellules.

Virus

Une grande partie de la recherche en biologie moléculaire porte sur les VIRUS, lesquels constituent la forme de vie la plus simple. Ils ne possèdent ni structure complexe, ni membrane cellulaire. Le chercheur canadien Felix d'Herelle a été parmi les premiers à faire des recherches fondamentales sur les virus. C'est lui qui a découvert les bactériophages (virus affectant les bactéries). Les virus sont composés d'ADN ou d'ARN associé à des protéines. Ils constituent donc de bons modèles pour l'étude de la réplication (la synthèse de l'ADN), de la transcription et de la traduction.

Les bactériophages ont été les premiers étudiés de façon approfondie. On comprend mieux la synthèse de l'ADN dans ces virus surtout grâce aux études faites par le biochimiste américain A. Kornberg (prix Nobel, 1959). Plus récemment, on a utilisé les virus eucaryotes (ceux qui s'attaquent aux cellules contenant un noyau véritable). On peut considérer le virus comme un microcosme des cellules et des tissus animaux. Les mécanismes contrôlant son activité biochimique sont semblables à ceux des cellules. Les virus dont le matériel génétique est composé d'ARN sont appelés rétrovirus. Certains rétrovirus sont considérés comme responsables du CANCER chez l'homme. Cependant, la plupart des virus qui attaquent les cellules eucaryotes sont des virus à ADN.

Génie génétique

La biologie moléculaire s'est surtout développée à la suite de la mise en oeuvre des techniques de l'ADN recombinant (GÉNIE GÉNÉTIQUE). Ces techniques ont été rendues possibles par la découverte et l'isolement, en 1970, des enzymes de restriction par le biochimiste américain Hamilton Smith (prix Nobel, 1978). Les enzymes de restriction permettent de couper la molécule d'ADN en des points bien précis (des séquences précises de bases). Des enzymes de liaison permettent de relier ensemble des fragments d'ADN.

C'est en 1977 qu'on a réussi pour la première fois à former de l'ADN recombinant formé de segments d'ADN provenant d'un mammifère insérés dans de petites structures bactériennes appelées plasmides. Les plasmides sont de petites boucles d'ADN présentes dans certaines bactéries, mais qui ne font pas partie du chromosome de la bactérie. La seconde découverte d'importance est celle de l' « épissage des gènes ». Dans les cellules eucaryotes, le brin d'ARN immédiatement produit à partir de l'ADN est plus grand que le brin d'ARN messager utilisé pour produire la protéine. En effet, les segments d'ARN produits qui ne sont pas nécessaires à la production de la protéine sont découpés et les segments restant sont liés ensemble.

Ces découvertes ont été suivies par le développement de méthodes puissantes, rapides et relativement faciles permettant de séquencer l'ADN (déterminer l'ordre des bases azotées formant la molécule). Différentes techniques ont été développées par le laboratoire de Walter Gilbert (Cambridge, Massachusetts) et par celui de Fred Sanger (Cambridge, Angleterre). Gilbert, Sanger et Paul Berg, un Californien qui a été le premier à pratiquer des expériences de clonage, ont reçu le prix Nobel en 1980. L'automatisation du séquençage de l'ADN, développée par Leroy Hood, a rendu possible le projet de génome humain ainsi que d'autres mégaprojets de séquençage de bactéries, de champignons et d'unNÉMATODE .

Au début des années 60, le Canadien d'origine Julius Marmur et l'Américain Paul Doty ont décrit des expériences de séparation des brins d'ADN, de leur réappariement et de leur hybridation. Lorsqu'on chauffe de l'ADN, les forces qui maintiennent les paires de bases ensemble, et donc les deux brins antiparallèles, se brisent et les brins se séparent l'un de l'autre (processus appelé fusion de l'ADN). Si la solution d'ADN est refroidie lentement, les brins s'associent de nouveau (réappariement) et le jumelage de bases est restauré, de même que la structure d'ADN à deux brins antiparallèles. Cette découverte a permis de développer deux techniques : la mutagénèse dirigée et l'amplification en chaîne par polymérase (ACP).

Gobind KHORANA a été le premier à synthétiser de l'ADN en éprouvette et a ainsi grandement contribué au développement de ces techniques. Si on ajoute à une solution d'ADN fusionné un fragment d'ADN de synthèse dont la séquence de bases est semblable, mais non identique, ce fragment peut s'apparier à l'ADN lors du refroidissement (hybridation). Une nouvelle molécule à deux brins est ainsi créée : un brin provient de l'ADN fusionné et l'autre de l'ADN de synthèse. La différence de bases introduite est considérée comme une mutation qui peut être reproduite en utilisant les enzymes de réplication de l'ADN.

Le Canadien Michael SMITH (prix Nobel, 1993) a développé la mutagénèse dirigée en parallèle avec son travail à l'U. de la Colombie-Britannique. Il a partagé son prix avec l'Américaine Kary Mullis qui a inventé la méthode ACP qui permet la multiplication en de nombreux exemplaires identiques (amplification) de n'importe quel segment d'ADN. La méthode combine les propriétés d'hybridation de l'ADN à la capacité de synthétiser de petits fragments d'ADN en éprouvette. Elle nécessite également l'utilisation d'enzymes thermiquement stables (des ADN polymérases actives, même à des températures aussi élevées que 95 °C) provenant de bactéries présentes dans les SOURCES chaudes et les cheminées de volcans sous-marins.

Deux petits fragments d'ADN synthétique pouvant s'hybrider aux séquences délimitant une région d'un chromosome que l'on désire étudier servent d'amorce (point de départ de la réplication) à la synthèse du nouveau brin d'ADN. On chauffe le mélange contenant l'ADN étudié, l'ADN polymérase et les amorces. Lorsque le mélange est refroidi, il y a alors hybridation entre les amorces et l'ADN fusionné.L'enzyme synthétise l'ADN désiré, un pour chaque brin, en commençant par les amorces. On fusionne ensuite l'ADN nouvellement synthétisé en augmentant la température rapidement, puis on refroidit immédiatement la solution. Puisque l'enzyme utilisée pour la synthèse est thermostable jusqu'à 95 °C, il est possible de répéter le processus à plusieurs reprises. Un appareil spécial, le cycleur thermique, est employé pour faire varier la température rapidement et pour chronométrer précisément la réaction de synthèse. Après 25 à 30 cycles, on obtient généralement une quantité suffisante d'ADN, assez pour effectuer une analyse séquentielle ou pour s'en servir dans d'autres études.

Évolution de la génétique classique et moléculaire

La combinaison de toutes ces technologies a complètement transformé la génétique classique et moléculaire. La capacité d'identifier et de séquencer les gènes a permis d'expliquer, à un niveau moléculaire, certaines observations cliniques et de mieux comprendre plusieurs MALADIES HÉRÉDITAIRES. Un exemple est celui de l'identification du gène (et de ses formes mutées) responsable de la plupart des cas de fibrose kystique par les Canadiens Lap-Chee TSUI et Jack Riordan et l'Américaine Frances Collins. Des modifications de l'ADN au niveau de la séquence des bases provoquent des différences dans la séquence de l'ARN messager. Lorsque celui-ci est traduit en protéine, il produit la mauvaise protéine ou une protéine altérée, ce qui résulte en une dysfonction caractéristique des maladies héréditaires.

Beaucoup de concepts de génétique ont été remis en question. Par exemple, on a prouvé l'existence de plusieurs clones d'un grand nombre de protéines. La combinaison de la mutagénèse dirigée et de l'ACP fournit un moyen très efficace pour mettre en évidence les défauts génétiques, développer des tests de dépistage et, éventuellement, réparer ces défauts. L'utilisation des enzymes de restriction, des techniques d'hybridation de l'ADN et de l'ACP a également permis l'identification des individus par leurs empreintes génétiques. Cette méthode, mise en oeuvre pour la première fois par Alec Jeffries en Angleterre, s'applique aussi bien à des humains, à des animaux ou à des plantes.

La mutagénèse dirigée permet de transformer un acide aminé en protéine, en modifiant la séquence de l'ADN qui code pour cette protéine. Cela permet d'identifier le rôle spécifique de certains acides aminés dans une protéine (p. ex. les acides aminés du site actif d'une enzyme). Il est possible de comparer ensuite ces résultats à d'autres données comme celles obtenues par l'analyse de la structure de la protéine à l'aide de la cristallographie par rayons X. On peut alors réussir à déterminer la fonction de chacun des acides aminés de la protéine.

L'évolution constitue aujourd'hui une nouvelle branche de la biologie moléculaire, la théorie selon laquelle la vie sur la Terre se serait développée en utilisant l'ARN comme matériel génétique; l'ADN ne serait apparu que bien longtemps après. La crédibilité de cette théorie a été établie à la suite de la découverte de molécules d'ARN (ribozymes) qui agissent comme des enzymes pouvant découper les molécules d'ARN. Le Canadien d'origine Sidney ALTMAN et l'Américain Thomas Cech (prix Nobel, 1989) ont chacun découvert l'autosegmentation de l'ARN et la fonction des ribozymes.

Apport du Canada

Les Canadiens ont grandement contribué au développement de la biologie moléculaire. Gobind Khorana (prix Nobel, 1968), qui a été le premier à synthétiser chimiquement une molécule d'acide nucléique, a commencé ses recherches aux BC Fisheries Research Laboratories à Vancouver. Gordon Tener et Michael Smith ont été parmi les nombreux étudiants de Khorana. Tener a développé une colonne chromatographique pour séparer les acides nucléiques en fonction de leur taille, une invention qui a eu un impact extrêmement grand en biologie moléculaire. Smith, quant à lui, était membre de l'équipe de Sanger lors du premier séquençage de la molécule d'ADN d'un virus en 1977.

Différentes équipes entreprennent maintenant des recherches en biologie moléculaire dans les laboratoires des facultés de médecine et de sciences des principales universités canadiennes, dans les laboratoires des compagnies de BIOTECHNOLOGIE de la plupart des provinces et dans les nombreux laboratoires provinciaux et fédéraux.

Voir aussiCONSEIL NATIONAL DE RECHERCHES DU CANADA; RECHERCHE, ORGANISMES PROVINCIAUX DE.